III miRNA 1st Stand Synthesis Kit 反转录
Script III miRNA 1st Stand Synthesis Kit 采用Poly(A)加尾法原理， 首先miRNA 3’末端加Poly(A)尾，再使用Anchored oligo(dT)-universaltag通用逆转录引物进行逆转录反应，最终生成miRNA 对应的cDNA 第一链。III miRNA 1st Stand Synthesis Kit 反转录
Script III miRNA 1st Stand Synthesis Kit 增强型miRNA cDNA 第一链合成试剂盒（加尾法）
III miRNA 1st Stand Synthesis Kit 反转录
目录号：71418
产品内容
Components | 71418-25 25 rxns (20 μl/rxn) |
miRNA RT Enzyme Mix | 50 μl |
2 × miRT Reaction Mix | 250 μl |
RNase free H2O | 1 ml |
保存条件
-20℃保存，有效期 12 个月。
产品简介
Script III miRNA 1st Stand Synthesis Kit 采用Poly(A)加尾法原理， 首先miRNA 3’末端加Poly(A)尾，再使用Anchored oligo(dT)-universaltag通用逆转录引物进行逆转录反应，最终生成miRNA 对应的cDNA 第一链。
本产品采用特殊优化预混合miRNA RT Enzyme Mix，将Poly(A)加尾和反转录合并为一步完成，简化了操作步骤并提高了Poly(A)加尾和逆转录效率。
本产品具有可从20pg-2μg 的Total RNA中高效制备miRNA对应的cDNA 第一链。一次合成的cDNA可检测多个microRNA，节约了RNA样品和成本。
注意事项
1． 为保证反转录成功，建议使用高质量的RNA样品，以及避免RNase污染。
2． 在反应中使用的total RNA 必须包含有小分子RNA(miRNA)。此过程也可以使用富集的miRNA， 单纯miRNA无法直接用分光光度计定量，建议直接加入2μl ~5μl。可根据目的miRNA丰度决定加入量，但是对于低丰度miRNA 样品而言(如血清血浆提取物)，可直接加入最大体积8 μl。
3． miRNA RT Enzyme Mix比较粘稠，容易吸附在管壁和吸头外，导致损失，使用前请点甩离心后取用。miRNA RT Enzyme Mix包含的酶是过量的，即使每次分别按照1.8 μl使用，也不影响使用效果。
miRNA 第一连 cDNA 合成 (以 20 μl 反应体系为例)
重要提示：操作前，请将各组分轻弹混匀，点甩离心后置冰上备用。
1． 反应体系的配制 (先加其他组分，最后再加入miRNA RT Enzyme Mix)于冰上，在PCR管中，加入以下组分：
Components | Volume |
Total RNA | 2 μg |
2 × miRT Reaction Mix | 10 μ |
miRNA RT Enzyme Mix | 2 μl |
RNase-Free H2O | Up to 20 μl |
轻柔吸打混匀，点甩离心，收集溶液至管底。
2． 42℃孵育60 min，进行miRNA 3’末端Poly (A)加尾和逆转录反应。
3． 85°C加热5 sec，终止反应。
逆转录产物可立即用于qPCR反应，或保存于-20°C，并在半年内使用；长期存放，请分装后存于-70°C。
qPCR
推荐按照miRNA Real-Time PCR Assay kit 进行定量实验。
按照上述操作步骤得到的cDNA模板，用于下游PCR或者荧光定量PCR检测时，可以根据实际情况选择使用量，对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，可根据所检测miRNA 的丰度适当的稀释cDNA（5-10倍或者100倍）后使用。如果发现有非特异扩增条带，或者融链曲线显示有非特异扩增，往往提示cDNA模板过量，可以尝试将上述cDNA模板稀释几十到几百倍甚至上千倍再使用。
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