Script IV RT Kit With gDNA Eraser 反转录
Script IV RT Kit With gDNA Eraser是一种高效、稳定、快速并具有清除高达260ng基因组DNA污染能力的高温逆转录系统，采用第四代高达60℃的全新高温逆转录酶，可以通读GC含量丰富，二级结构复杂的RNA模板，极大提高了逆转录效率和长度，CT值一般提早2-3个循环。Script IV RT Kit With gDNA Eraser 反转录
Script III RT Kit With gDNA Eraser
（Perfect for qPCR）
Script IV RT Kit With gDNA Eraser 反转录
目录号:71614
产品内容
Components | 71614-50 50 rxns (20 μl/rxn) | 71614-100 100 rxns (20 μl/rxn) |
5x RT Mix IV | 200 μl | 400 μl |
4x gDNA Eraser Mix | 50 μl | 100 μl |
RNase free H2O | 1.5 ml | 1.5 ml |
保存条件
-20℃保存，有效期 12 个月。
产品简介
Script IV RT Kit With gDNA Eraser是一种高效、稳定、快速并具有清除高达260ng基因组DNA污染能力的高温逆转录系统，采用第四代高达60℃的全新高温逆转录酶，可以通读GC含量丰富，二级结构复杂的RNA模板，极大提高了逆转录效率和长度，CT值一般提早2-3个循环。
其中5x RT Mix IV为一管式逆转录预混液，含有逆转录所需的所有试剂（Script IV Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo dTPrimer、dNTP Mixture、RT Buffer），并且，针对qPCR进行特别优化oligodT和N6随机引物配比，使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始并具有相同的逆转录效率，zui大程度保证了qPCR结果的真实性和可重复性。
适用范围
第一链cDNA合成，尤其高GC含量，复杂模板的cDNA合成。可用于高拷贝、低拷贝基因的检测。
注意事项
1． 建议使用 0.2ml RNase-free PCR 管在冰上配制反应液，并用 PCR 扩增仪精准控温。
2． 为保证反转录成功，建议使用高质量的 RNA 样品，及避免 RNase 污染。
3． 20μl 逆转录反应体系建议加入不超过 1μg 的 Total RNA。如果目的基因的表达量非常低，最多加入 5μg 。
4． 本产品适用于包含 Ploy (A)结构的真核生物 mRNA 和不包含 Ploy (A)结构的原核生物RNA、真核生物rRNA和tRNA等模板，但不适用于miRNA等小 RNA 模板。
5． 5x RT Mix IV 和 4x gDNA Eraser Mix 比较粘稠，容易吸附在管壁和吸头外，使用前，请先点甩离心。5x RT Mix IV 和 4x gDNA Eraser Mix 包含的酶过量，即使每次分别按照 3.8μl、0.9μl 使用，也不影响结果。
第一连 cDNA 合成 (以 20 μl 反应体系为例)
重要提示：操作前，请将各组分轻弹混匀，点甩离心后置冰上备用。
1． 去除基因组DNA
于冰上，在PCR管中，加入以下组分：
Components | Volume |
Total RNA / mRNA | 50ng ~ 1μg / 5ng ~ 100ng |
4x gDNA Eraser Mix | 4 μl |
RNase-free H2O | To 16 μl |
用移液器轻轻吸打混匀，42°C 孵育 2 min，以去除基因组 DNA 污染。
2． 逆转录反应
把步骤1的反应管放在冰上，加入4 μl 5x RT Mix IV，轻柔吸打混匀，瞬离，设置反应程序：
① mRNA模板来源于真核细胞(植物、动物)，含有Poly(A)尾结构：50℃孵育15min；
② mRNA模板来源于原核细胞(细菌)、病毒，不含Poly(A)尾结构：25℃孵育10min；50℃孵育15 min。
注意：若模板具有复杂二级结构或高GC区域，把50°C的孵育温度提升至55-60°C，
有助于提高产量。
3． 终止反应
85°C加热5 sec，失活RTase和gDNA Eraser。
逆转录产物可立即用于qPCR反应，或保存于-20°C，并在半年内使用；长期存放，请分装后存于-70°C。
qPCR
建议取1~2μl cDNA产物原液作为20μl qPCR反应体系的模板。如果基因表达量比较高，请根据实际情况适当稀释cDNA模板后使用。
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