1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂
Script IV 1st Strand cDNA Synthesis Kit（With dsDNase）采用第四代高达60℃的全新高温逆转录酶，可以通读GC含量丰富，二级结构复杂的RNA模板，极大提高了逆转录效率（CT值一般提早2-3个循环）和长度（可合成长达15 kb的cDNA以及高比例的全长cDNA）1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂
Script IV 1st Strand cDNA Synthesis Kit（With dsDNase）（for PCR or qPCR）
1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂
目录号：71414
产品内容
Components | 71414-50 50 rxns (20 μl/rxn) | 71414-100 100 rxns (20 μl/rxn) |
5x Reaction Mix IV | 200 μl | 400 μl |
dsDNase | 50 μl | 100 μl |
Oligo(dT)18 (0.5 μg /μl) | 50 μl | 100 μl |
Random primer (N6) | 50 μl | 100 μl |
RNase free H2O | 1.5 ml | 1.5 ml |
保存条件
-20℃保存，有效期 12 个月。
产品简介
Script IV 1st Strand cDNA Synthesis Kit（With dsDNase）采用第四代高达60℃的全新高温逆转录酶，可以通读GC含量丰富，二级结构复杂的RNA模板，极大提高了逆转录效率（CT值一般提早2-3个循环）和长度（可合成长达15 kb的cDNA以及高比例的全长cDNA）；可用于PCR、qPCR等下游实验。
Oligo(dT)18 和Random primer (N6)是独立组分，可以自由选用，以获得最合适的反转录结果！
本产品采用预混合技术和热敏性dsDNase，只需一步操作，15 min 即可同时完成基因组清除与逆转录反应，极大简化了操作步骤，避免了复杂加样过程造成的样品污染与RNA降解的风险。
引物的选择：
1. 如果RNA模板来源于真核生物，shou选Oligo (dT)，与真核生物mRNA的 3’PolyA尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
2. 如果对一些物种，不能确定mRNA是否有polyA尾的情况下，shou选Oligo(dT)，不成功再尝试基因特异性引物(GSP)和Random primer为引物。
3. 基因特异性引物(GSP)的特异性较高。但有些情况下，用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成，可改用Oligo (dT)或Randomprimer重新进行逆转录。
4. Random primer特异性zui低，所有RNA，包括mRNA，rRNA，tRNA均可以作为Random primer的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，使用Oligo (dT)或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成时，可使用Random primer为引物。
5. 如果合成cDNA下游用于qPCR，可将Oligo (dT)与Random primer混合使用（各加1μl /20μl反应体系），可使mRNA的各个区域cDNA合成效率相同，有助于提高qPCR结果的真实性和重复性。
第一连 cDNA 合成 (以 20 μl 反应体系为例)
1．反应体系的配制
提示：操作前，请将各组分轻弹混匀，点甩离心收集至管底，置冰上备用。
于冰上，在 RNase-Free PCR 管中加入以下组分：
Components | Volume |
Total RNA | 50 ng - 5 μg |
Oligo(dT)18 (0.5 μg /μl) or Random primer (N6) (0.1 μg/μl) or GSP (Gene Specific Primer , 2 pmol/μl) or | 1 μl |
1 μl | |
1 μl | |
5x Reaction Mix IV | 4 μl |
dsDNase | 1 μl |
RNase free H2O | To 20 μl |
2．轻柔吸打混匀，点甩离心，置 PCR 仪进行逆转录反应。
如用Oligo(dT)18或基因特异性引物(GSP)，产物用于PCR：50℃孵育30 min；
产物用于qPCR：50℃孵育15 min。
如用 Random Primer,25℃孵育10 min 后，产物用于 PCR，50℃孵育30 min；
25℃孵育 10 min 后，产物用于 qPCR，50℃孵育 15 min。
注意：如果模板具有复杂二级结构或高 GC 区域，可以先只加 RNA 模板、引物和 RNase free H2O，混匀，65℃变性 5 min，冰上冷却，点甩离心后加入其它成分，并将 50℃孵育温度提升至 55-60°C，有助于增强逆转效率。
3． 85°C加热 5 sec，失活RTase和dsDNase，终止反应。
逆转录产物可立即用于PCR或qPCR反应，或保存于-20°C，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-70°C保存，cDNA应避免反复冻融。
PCR
建议取2 - 4 μl的cDNA产物原液作为PCR模板。
1. 常规扩增：71019-2x Taq PCR MasterMix (30sec/kb)
71800-2x Lightning Taq PCR MasterMix (10sec/kb)
2. 高保真扩增：71812-2x FastHiFi PCR MasterMix (≤3kb片段)
71814-2×LongHiFi PCR MasterMix (≤10kb片段)
qPCR
建议取1~2μl cDNA产物原液作为20μl qPCR反应体系的模板。如果基因表
达量较高，请根据实际情况适当稀释cDNA模板后使用。
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