微量/临床基因组DNA快速提取试剂he
本试剂盒采用特制的进口DNA吸附柱和du特的缓冲液系统，特别适合于从微量血液、法医材料、干血点、药签、口香糖、尿液等微量样品中分离纯化基因组DNA。微量/临床基因组DNA快速提取试剂he
临床基因组DNA快速提取试剂盒（离心柱型）
微量/临床基因组DNA快速提取试剂he
目录号：40215
目录编号 | 包装单位 |
40215-50 | 50次 |
v 适用范围：
适合于从微量血液、法医材料、干血点、药签等微量样品中分离纯化基因组DNA。
v 试剂盒组成、储存、稳定性：
试剂盒组成 | 保存 | 50次 |
裂解液ML | 室温 | 11ml |
结合液CB | 室温 | 15ml |
抑制物去除液IR | 室温 | 25ml |
漂洗液WB | 室温 | 10ml 第一次使用前按说明加指ding量乙醇 |
Carrier RNA | -20℃ | 310μg |
洗脱缓冲液EB | 室温 | 10ml |
蛋白酶K fen（可选） 20mg/ml | -20℃ | 20mg |
吸附柱AC和收集管 | 室温 | 50套 |
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果
储存事项：
1. 结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2. 为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解。因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分装冻存，－20℃保存。
3. Carrier RNA 收到时为冻干粉状，使用前按照注意事项4配制和储存。
4. 避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。仔细阅读注意事项4。
v 产品介绍：
本试剂盒采用特制的进口DNA吸附柱和du特的缓冲液系统，特别适合于从微量血液、法医材料、干血点、药签、口香糖、尿液等微量样品中分离纯化基因组DNA。各种来源样品裂解消化处理后DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜（特别配备了Carrier RNA可以从体系中轻松捕获微量核酸），再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净的基因组DNA从硅基质膜上洗脱。纯化后的DNA无杂质和PCR抑制剂，可直接适用于PCR分析。
v 产品特点：
1. 不需要使用有毒的苯fen等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
2. 节省时间，简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成。
3. 配备了Carrier RNA 用于充分收集特别微量DNA。
4. 多次柱漂洗确保高纯度，提取的DNA 纯度高，质量稳定可靠，可适用于各种常规操作，包括PCR、酶切、测序、Southern 杂交等。
v 注意事项：
1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2. 开始实验前将需要的水浴先预热到所需温度备用。部分样品需要准备1M DTT。
3. 结合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4. Carrier RNA ：
1) Carrier RNA收到时为冻干状，使用时加入310μl RNase free 水充分溶解，配制成1μg/μl 溶液。Carrier RNA溶液应避免反复冻融，冻融次数不能超过3 次。所以建议在第一次使用时按自己每次的用量分装在RNase-free 的离心管中后置于－20℃储存。
2) Carrier RNA使用方法：如果起始处理量很少（例如小于10μl全血和法医样品），我们推荐使用Carrier RNA，如果预期有较大量DNA产量，用户可以根据需要选择是否加入Carrier RNA。使用时在每个样品提取所需结合液CB 中加入1μl Carrier RNA储存溶液， 将结合液CB 与Carrier RNA溶液充分颠倒混匀即可(结合液CB容易起泡沫,请勿使用涡旋振荡混匀)。也可根据样品数量，在总共需要的结合液CB中加入总共需要的Carrier RNA混匀备用。混合液在室温24小时内稳定。
3) Carrier RNA加入过多造成DNA洗脱液中Carrier RNA浓度过高，下游PCR反应可能受干扰，加入过少可能并不能帮助提高DNA产量和PCR敏感度，因此加入量应该在具体试验中调整以得到优良效果。
4) 由于Carrier RNA 本身是小核酸，所以得到的基因组测定OD260 值会比真实值偏大，建议将得到的基因组直接用PCR 进行检测。
v 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
1. 血液样品
a. 取1-100μl血液到1.5ml 的离心管中。
b. 如果不足100μl，加入裂解液ML补足到100μl。
c. 加入10μl的蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混匀，再加入100μl结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10分钟。
如果处理样品<10μl,建议在100μl结合液CB 中加入1μl Carrier RNA储存溶液。
d. 冷却后加入50μl无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，室温放置3分钟。
如果周围环境高于25℃,乙醇需要冰上预冷后再加入。
e. 接操作步骤项下7。
2. 干血点
a. 用打孔机打孔的方法在血卡(上面有干血点) 上冲取3mm(1/8英寸) 直径血卡小片(上面有干血点),最多将3个直径3mm血卡小片放入1.5ml 的离心管中。
一般血液应该点在特定纸或者血卡上面干燥,如903 paper or IsoCode paper (Schleicher & Schuell), BloodstainCard or FTA Card (Whatman), Guthrie test cards, or comparable blood cards.
b. 加入180μl裂解液ML。
c. 加入20μl的蛋白酶K (20mg/ml)溶液，立刻涡旋振荡充分混匀。
d. 56℃轨道摇床上面900rpm振摇1小时。
如果没有可加热轨道摇床，可以在水浴或者heating block上面进行，每10分钟涡旋振荡10秒帮助裂解。
e. 加入200μl结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀。
如果只处理一个3mm血卡小片，建议在200μl结合液CB 中加入1μl Carrier RNA储存溶液。
f. 70℃轨道摇床上面900rpm振摇10分钟。
如果没有可加热轨道摇床，可以在水浴或者heating block上面进行，每3分钟涡旋振荡10秒帮助裂解。
g. 接操作步骤项下7。
3. 组织样品
a. 新鲜或者解冻的组织在液氮中研磨成细粉后或者用解剖dao切成小碎块（切成微块可以提高产量）后取<10mg，转入装有180μl裂解液ML的1.5ml离心管中，用大口径枪头吹打混匀。
b. 加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。
c. 将裂解物放置在56℃水浴过夜或者直到组织消化wan全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。
对于小量的组织，一般4－6小时即可，但是过夜消化可以得到优良结果。
d. 加入200μl 结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀。
如果处理样品量少, 建议在200μl结合液CB 中加入1μl Carrier RNA储存溶液。
e. 冷却后加200μl 无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，室温放置5分钟。
如果周围环境高于25℃,乙醇需要冰上预冷后再加入。
f. 接操作步骤项下7。
4. 口香糖
a. 将30mg口香糖切成小块放入1.5ml离心管，加入280μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。
b. 56℃轨道摇床上面900rpm振摇至少3小时。
如果没有可加热轨道摇床，可以在水浴或者heating block上面进行，每10分钟涡旋振荡10秒帮助裂解。
c. 加入200μl 结合液CB（加入1μl Carrier RNA），立刻涡旋振荡充分混匀。
d. 70℃轨道摇床上面900rpm振摇1小时。
如果没有可加热轨道摇床，可以在水浴或者heating block上面进行，每10分钟涡旋振荡10秒帮助裂解。
e. 冷却后加200μl无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀。
f. 最高速（约14,000rpm）离心1分钟，取上清加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。
g. 接操作步骤项下8。
5. 法医材料
a1. 剪下1 cm2烟头或者过滤嘴外层纸，切成6小块放入1.5ml离心管，加入300μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。接步骤b。
a2. 剪下0.5-2.5 cm2信封或者邮票，切成小块放入1.5ml离心管，加入300μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。接步骤b。
a3. 从毛发根部毛囊处开始剪下0.5-1 cm长度毛发放入1.5ml离心管，加入280μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)和20μl 1M DTT溶液，立刻涡旋振荡充分混匀。接步骤b。
a4. 将指甲剪成小块放入1.5ml离心管，加入280μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)和20μl 1M DTT溶液，立刻涡旋振荡充分混匀。接步骤b。
a5. 将约0.5cm2信封沾染了血液、唾液、精液的材料剪成小块放入1.5ml离心管，加入300μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml) (如果是精液需另加入20μl 1M DTT溶液)，立刻涡旋振荡充分混匀。接步骤b。
b. 56℃轨道摇床上面900rpm振摇1小时。
如果没有可加热轨道摇床，可以在水浴或者heating block上面进行，每10分钟涡旋振荡10秒帮助裂解。
一般毛发1小时裂解可以完成，如果不wan全可以延长时间。指甲等难裂解物建议过夜裂解。最后没有裂解的不溶物在后续步骤e中会通过离心去除。
c. 加入200μl结合液CB（加入1μl Carrier RNA），立刻涡旋振荡充分混匀。
d. 70℃轨道摇床上面900rpm振摇1小时。
e. 最高速（约14,000rpm）离心1分钟，取上清加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。
f. 接操作步骤项下8。
6. 微切割样品（包括福尔马林固定的微切割样品）
a. 加入15μl裂解液ML 到0.2 ml 离心管中，放入微切割样品。
b. 加入10μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml) ，立刻涡旋振荡充分混匀。
c. 56℃水浴3小时（福尔马林样品16小时）至裂解wan全，中间不时颠倒涡旋。
d. 加入15μl裂解液ML，再加入50μl结合液CB（加入1μl Carrier RNA），立刻涡旋振荡充分混匀。
e. 冷却后加入50μl无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，室温放置5分钟。
如果周围环境高于25℃,乙醇需要冰上预冷后再加入。
f. 接操作步骤项下7。
7. 将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。
8. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。
9. 加入500μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
10. 加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
11. 将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
12. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加20－50μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好），室温放置2-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于20μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
13. DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃。
v 问题与解决方法
问题 | 评论与建议 |
DNA产量低或者洗脱液中无DNA | *Carrier RNA没有加入到结合液CB-建议：仔细阅读注意事项4。 *样品冻融超过1次-建议：尽量使用新鲜样品和冻融不超过1次的样品。 *样品在室温放置过久-建议：尽快处理样品或者低温适当方式保存。 *裂解不wan全，蛋白酶K失效了-建议：收到蛋白酶K后，按照每次使用量分装冻存，避免反复冻融。 *结合液CB和Carrier RNA没有充分混匀-建议：充分颠倒混匀。 *试剂和样品没有充分混匀-建议：加入每个试剂后都要充分混匀。 *洗脱效率不高-建议：确保做了步骤11，否则残留乙醇会影响洗脱效率，仔细阅读步骤12和只使用洗脱缓冲液EB洗脱。 |
DNA的下游反应如PCR效果不佳 | * DNA产量低或者洗脱液中无DNA-建议：在下游反应中增加DNA用量。 * 洗脱液中太多或者太少的Carrier RNA-建议：确定在下游应用中Carrier RNA的最大允许量，调整结合液CB中加入Carrier RNA的用量。仔细阅读注意事项4。 * 降低的灵敏度-建议：确定在下游PCR应用中DNA洗脱液的最大允许用量，减少或者增加DNA洗脱液在PCR反应中的用量，DNA洗脱体积也可以相应的调整。 |
DNA下游酶切 | *离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇抑制了酶切反应-建议：确保做了步骤11，然后空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。 *一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反应-建议：将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟，小心取上清使用。 |
A260吸光值 | *一些硅基质膜成分一起洗脱下来，干扰了吸光值-建议：将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟，小心取上清使用。 |
微量/临床基因组DNA快速提取试剂he
