NobleRyder RIPA裂解液(强)
NobleRyder RIPA裂解液(强) 即用型液体试剂 P4813-100ml
NobleRyder RIPA裂解液(强)
产品简介:
多种成分均可以从细胞中提取总蛋白,例如 Triton、SDS、NP-40 等。RIPA 裂解液(强) (Enhanced RIPA Lysis Buffer ),是采用一种经典的细胞组织快速裂解,并获得总蛋白的裂解液,其裂解强度大于 NP-40 裂解液、RIPA 裂解液(中)。所获得的蛋白质可以用于 Western,免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)等。Enhanced RIPA Lysis Buffer 主要由 Tris 、NP-40、sodium deoxycholate 等组成,并含有多种蛋白酶抑制剂成分,可以有效抑制蛋白的降解,并维持原有的蛋白间相互作用。
产品组成:
编号 名称 | P4813 | Storage |
Enhanced RIPA Lysis Buffer | 100ml | -20℃ |
PMSF(100mM) | 1.5ml | -20℃ |
使用说明书 | 1份 |
操作步骤(仅供参考):
(一)贴壁培养细胞
1、 取 Enhanced RIPA Lysis Buffer 室温溶解混匀,加入 PMSF,使 PMSF 终浓度为 1mM。
2、 去除贴壁细胞的培养液,用 PBS、NS 或无血清培养液清洗 1 次,低速离心,弃上清,留取沉淀。
3、 按照 6 孔板每孔加入 150~250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例,加入 RIPA Lysis Buffer 。移液器轻轻吹打,使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或 4℃裂解 15~30min,通常裂解液作用于细胞 1~3 秒内,细胞就会被裂解。通常 6 孔板每孔细胞加入 150μl 裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200~250μl。
4、 10000~12000g,4℃离心 5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。5、 进行后续的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)悬浮培养细胞
1、 取 Enhanced RIPA Lysis Buffer 室温溶解混匀,加入 PMSF,使 PMSF 终浓度为 1mM。
2、 低速离心悬浮细胞,弃上清,收集沉淀。
3、 用手指轻弹细胞,使其松散。按照 6 孔板每孔细胞加入 150~250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例,加入 Enhanced RIPA Lysis Buffer。通常 6 孔板每孔细胞加入 150μl 裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200~250μl。再用手指轻弹以充分裂解细胞,充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
4、 10000~12000g,4℃离心 5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。5、 进行后续的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)组织样本
1、取 Enhanced Lysis Buffer 置于室温溶解混匀,,加入 PMSF,使 PMSF 终浓度为 1mM。
2、把组织jian切成细小的碎片,越小越好。取在液氮或超低温冰箱中冷冻 30min 以上的组织,迅速用液氮研磨,研磨过程尽量控制在 1~2min 之内,以减少蛋白的降解。
3按照每 20mg 组织加入 150~250μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的裂解液。冰上或 4℃
裂解 15-30min。
4、步骤 3、4 亦可以采用如下过程:按照每 20mg 组织加入 150~250μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的 Enhanced RIPA Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆,直至充分裂解,该过程尽量控制在 1~2min 之内,以减少蛋白的降解。
5、 10000~12000g,4℃离心 5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。6、 进行后续的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
注意事项:
1、 去除贴壁细胞的培养液后,如果血清中的蛋白没有干扰,可以丌用清洗。
2、 如果裂解丌充分可以适当增加裂解液的用量,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减
少裂解液的用量。
3、 如果细胞量较多,必需分装成 50~100 万细胞/离心管,然后再裂解。大团的细胞较难
裂解充分,而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触,相对比较容易裂解充分。
4、 如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈 Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清,用于后续实验。
5、 溶解 NobleRyder RIPA Lysis Buffer 时,应尽量缩短溶解时间,避免有效成分失效。
6、 裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组 DNA 等的复合物。在丌检测和基因组 DNA 结合特别紧密的蛋白的情况下,可以直接离心取上清用于后续实验;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子,例如 NF-KB、p53 等时,通常丌必进行超声处理,就可以检测到这些转录因子。
7、 细胞裂解的操作步骤,应置于冰上或 4℃进行。
有效期: 12 个月有效。
NobleRyder RIPA裂解液(强)