NobleRyder RIPA裂解液(弱)
NobleRyder RIPA裂解液(弱) 即用型液体试剂 P4811-100ml
RIPA裂解液(弱)
产品简介:
多种成分均可从细胞中提取总蛋白,如Triton、SDS、NP-40等。RIPA裂解液(弱) (Weak RIPA Lysis Buffer )是采用一种温和的裂解方法获得总蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可用于PAGE电泳、Western、免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等。
NobleRyder Weak RIPA Lysis Buffer主要由Tris 、NP-40、sodium deoxycholate等组成,并含有多种蛋白酶抑制剂成分,可以有效抑制蛋白的降解,并维持原有的蛋白间相互作用。
NobleRyder RIPA裂解液(弱)
产品组成:
编号 名称 | P4811 | Storage |
Weak RIPA Lysis Buffer | 100ml | -20℃ |
PMSF(100mM) | 1.5ml | -20℃ |
使用说明书 | 1份 |
操作步骤(仅供参考):
(一)贴壁培养细胞
1.取Weak RIPA Lysis Buffer置于室温溶解混匀,加入PMSF,使PMSF终浓度为1mM。
2.去除贴壁细胞的培养液,用PBS、NS或无血清培养液清洗1次,低速离心,弃上清,留取沉淀。
3.按照6孔板每孔加入150~250μl含有PMSF的裂解液的比例, 加入Weak RIPA Lysis Buffer。移液器轻轻吹打,使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或4℃裂解,通常裂解液作用于细胞1~3s内,细胞就会被裂解。通常6孔板每孔细胞加入150μl裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200~250μl。
4.10000~12000g,4℃离心5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。
5.后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)悬浮培养细胞
1.取Weak RIPA Lysis Buffer 置室温溶解混匀后,加入PMSF,使PMSF终浓度为1mM。
2.低速离心悬浮细胞,弃上清,收集沉淀。
3.用手指轻弹细胞,使其松散。按照6孔板每孔细胞加入150~250μl含有PMSF的裂解液的比例,加入Weak RIPA Lysis Buffer 。通常6孔板每孔细胞加入150μl裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200~250μl。再用手指轻弹以充分裂解细胞,充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
4.10000~12000g,4℃离心5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。
5.进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)组织样本
1.取Weak RIPA Lysis Buffer置于室温溶解混匀后,加入PMSF,使PMSF终浓度为1mM。
2.把组织jian切成细小的碎片,越小越好。
3.取在液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织,迅速用液氮研磨,研磨过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。
4.按照每20mg组织加入150~250μl裂解液的比例,加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解15~30min。
步骤3、4亦可以采用如下过程:按照每20mg组织加入150~250μl裂解液的比例加入含有PMSF的Weak RIPA Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆,直至充分裂解,该过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。
5.10000~12000g,4℃离心5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。
6.进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
注意事项:
1.去除贴壁细胞的培养液后,如果血清中的蛋白没有干扰,可以不用清洗。
2.如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。
3.如果细胞量较多,必需分装成50~100万细胞/离心管,然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分,而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触,相对比较容易裂解充分。
4.如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清,用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便,不必使用匀浆器,缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
5.溶解NobleRyder RIPA Lysis Buffer时,应尽量缩短溶解时间,避免有效成分失效。
6.裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下,可以直接离心取上清用于后续实验;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子,例如NF-KB、p53等时,通常不必进行超声处理,就可以检测到这些转录因子。
7.细胞裂解的操作步骤,应置于冰上或4℃进行。
有效期: 12个月有效。
NobleRyder RIPA裂解液(弱)