IDT NGS二代测序微卫星不稳定性MSI解决方案
--文库构建试剂盒、定制化Panel杂交捕获探针组
北京云肽生物科技代理的IDT NGS二代测序产品，通过高质量文库构建试剂盒、稳定的定制化Panel杂交捕获探针组、对手动或自动化工作站的高通量处理支持，成为微卫星不稳定性(MSI)实验室基础研究的高效工具。
一、背景介绍
微卫星不稳定性(Microsatellite Instability，MSI)是指在DNA复制时由于重复单位的插入或缺失引起的微卫星(Microsatellite,Ms)序列长度改变的现象，常由错配修复功能(Mismatch repair，MMR)缺陷引起。微卫星不稳定性MS!现象于1993年在结直肠癌中shou次发现。据MSI被检测出的频率可以分为三类：微卫星高度不稳定性(MS·H)、微卫星低度不稳定性(MSIHL)、微卫星稳定(MS·S)。随着诊疗水平的进步和靶向药物、免疫治疗的出现，免疫检查点抑制剂应用的越来越广泛。MSI微卫星不稳定性是一种预测患者对免疫检查点抑制剂反应的重要生物标志物，同也是一个泛癌种生物标志物，在肿瘤的诊断和治疗中扮演着重要角色。
随着高通量测序平台的广泛使用和二代测序NGS成本的降低，NGS平台目标区域测序(NGS Panel)或WES全外显子组测序逐渐也应用于微卫星不稳定性MSI的检测中。NGS检测通量大、灵敏度及持异性高，采用NGS Panel一次性可以检测上千个MSI位点、错配修复功能MMR基因状态及其他分子标志物。同时，基于外周血循环肿瘤DNA(ctDNA)的MSI微卫星不稳定性的检测，也为肿瘤组织取样困难或不足的晚期实体瘤患者MSI检测提供了新选择。
二、
IDT NGS二代测序解决方案
1、IDT xGen cfDNA& FFPE DNA 文库制备试剂盒
优势
①提升样本转化率，达到更高的文库复杂度；
②结合UMI纠错处理，实现低频突变的检测;
③为困难样本量身打造，更大化数据输出。
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图. IDT xGen cfDNA&FFPE DNA文库制备试剂盒提供了非常高的转化率和文库复杂度，从而在目标区城获得更好的覆盖深度。使用10ng的cDNA标准品并按照IDT提供的标准流程进行文库制备，并用限盖16kb的定制IDT xGen Custom HybPanels.Production 探针对文库进行靶向捕获。捕获后的文库混合起来并在lIIumina Nextseq550 测序仪上进行测序。采用BWA(0.7.15)对测序数据进行比对，并用Picard(2.18.9)进行覆盖深度和复杂度(评估单一分子数，使用参数为HS文库大小)的计算。
图. IDT xGen cfDNA&FFPE DNA文库制备试剂盒提高对低频突变的检测灵敏度和特异性。使用25ng的cfDNA标准品按照IDT提供的标准流程进行文库制备，标准品中突变基因的频率(MAF)为0.25%。使用61kb的定制IDT xGen Custom HybPanels-Production探针进行文库捕获，在测序后使用BWA(0.7.15)进行比对并按照IDT xGen cfDNA&FFPE试剂盒分析指南所述进行stanrt-stop去重，或者按照combined read families的方法进行去重和错误校正。最后使用VarDict(1.5.8)识别变异。PPV=阳性预测值，是衡量突变检出准确度的指标。
2、IDT xGen Custom Hyb Panels-Production 探针库
IDT xGen Custom HvbPanels·Production 探针是带有5'端生物素标记的DNA探针，每一条探针均经过单独合成、单独质检，可用于NGS二代测序中对目标序列进行富集。实验证明，与通过微阵列合成的捕获探针相比，IDT xGen Custom Hyb Panels-Production探针实现的捕获均一性更高，GC偏好性更少，能够以更少的测序次数获得更佳的测序深度。IDT xGen Custom Hy b Panels·Production 探针库可用模块化的方式进行制备和使用，既可以独立使用，也可以通过spike-in panel的形式与现有的探针库结合使用，具有非常高的灵活性，是品质稳定、性能优异的捕获探针选择。
优势
①单独合成、单独质控的探针，实现高效均一的目标富集;
②模块化设计，实现经济高效的定制和简单轻松的目标靶点扩充;
图3.使用IDT的探针库实现高度均一的目标区域覆盖。针对标准品基因组DNA(Coriell)构建文库，使用lDT xGen Custom Hyo Panels-Production 探针库进行捕获反应(目标区城为88kb)。富集后的文库在lllumina Nextseq测序仪进行测序，并对600Kreads进行生信分析。结果显示，(A)单次测序的覆盖均一度较高;(B)同一个探针库的两个不同批次，显示出较高的一致性。
三、成功案例
研究人员使用了IDT xGen Exome Hyb Panel2 以及定制化的IDT xGen Custom Hyb Panels-Production探针库(包含150个癌症相关基因)，进行了基于血浆样本的微卫星不稳定MS!检测的技术验证和临床验证。这是国内通过临床疗效验证的bMSI检测，该研究同时也对中国18个癌种5000+例真实大样本进行了MSI微卫星不稳定的检测以及数据的总结。
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该研究对经PCR-MSI检测确认的40例tMSI-H和209例tMSS晚期胃肠肿瘤患者的外周血进行技术验证。该bMSI算法筛出33例tMSI-H患者和201例tMSS患者，与“金标准"组织PCR对照准确性达到94%(灵敏度:82.5%，特异性:96.2%)。
表.通过二代测序的方法检测血液微卫星不稳定性(bMSI)与组织PCR检测MSI(tMSI)时结果的一致性。
IDT为NGS靶向捕获实验提供端到端的产品覆盖，并在精准性、经济性和稳定性这三个方面具有显著优势。
①精确性:IDT埃丰富的UMI接头选择，结合以IDT xGen cfDNA&FFPE DNA文库制备试剂盒为代表的新颖的建库方法，可大大提高样本转化率和检测灵敏度;高质量的探针合成为高效检测体细胞突变和甲基化水平打下了坚实的基础，助力ctDNA的多维度研究。
②经济性:IDT xGen Custom HybPanels·Accel 探针库进一步降低使用门槛，加快探针交付速度，让新项目快人一步。
③稳定性:超过30年的寡核苷酸合成经验，结合独特的化学合成工艺和严格的质控方法，使IDT xGen Custom Hyb Panels-Production 探针组的表现稳定。
四、IDT微卫星不稳定性MSI相关产品
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